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多重免疫组化技术助力肿瘤精准治疗 -提供可视化肿瘤微环境信息
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肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)是一个复杂的综合系统,主要由肿瘤细胞、周围的免疫和炎症细胞、肿瘤相关的成纤维细胞、附近的间质组织、微血管、各种细胞因子和趋化因子构成。肿瘤细胞与其所处的微环境作为一个功能整体,两者相互影响、共同进化,所以肿瘤的发生与发展不仅与肿瘤细胞本身相关,同样与TME密切相关[1]。在过去的十年中,TME已经成为癌症治疗最重要的研究对象之一[2]

随着精准医疗的发展,在各类癌症的免疫治疗应用中,对临床评估TME的需求也越来越强烈[3-5],而当下免疫肿瘤学研究多集中在特定免疫细胞亚群在其空间环境中的作用。对TME更深层次信息的需求推动了新技术的发展,如多路成像[6]、质谱流式细胞术[7]及单细胞RNA测序[8]。虽然质谱流式细胞术和单细胞测序是研究TME的有效方法,但无法很好地解释肿瘤细胞与周围各要素之间的空间联系。
利用免疫学和细胞化学原理,多重免疫组化(Multiple Immunohistochemistry, mIHC)技术通过在同一张切片上同时或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物,来原位示踪组织或细胞内不同的抗原大分子物质。mIHC采用呈现不同颜色的荧光色素配伍,分别标记不同的抗体,再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示。
与大规模细胞检测和单细胞转录分析相比,mIHC技术不仅可以使FFPE样本在更好的分辨率下显示肿瘤细胞与TME的关系,而且其技术原理相对成熟且操作便捷,在TME研究中具有独到的优势[10]

mIHC检测肿瘤微环境相关信息,为免疫治疗提供更全面评估

在肿瘤精准治疗时代,现有的生物标志物识别模式(即根据特定基因的突变检测结果预测药效)并不适用于所有受到免疫治疗的患者[11]肿瘤的异质性决定了其肿瘤微环境的复杂性,而肿瘤中免疫细胞的活化/抑制状态、免疫细胞密度、肿瘤细胞之间的空间位置甚至肿瘤内微血管的生成等都将对免疫治疗的应答评估产生重要影响。多种途径共同决定了肿瘤和免疫细胞之间的相互作用,将这种相互作用精炼到一个单一的生物标志物提升了靶向药物或免疫药物的有效率,但是从某种程度上讲也是一种过分简化[11]

Taube等人通过mIHC对非小细胞肺癌石蜡包埋组织切片进行处理。结果发现肿瘤细胞与CD68+巨噬细胞均表达PD-L1,罕见的CD8+ T细胞部分表达PD-1,同时环境中存在FoxP3+调节性t细胞(图1)[11]。研究人员认为,未来的生物标志物策略无疑将包括对肿瘤先天和适应性免疫反应以及肿瘤本身内在特征的更全面的评估。肿瘤微环境在某些肿瘤类型中被认为与预后独立相关,未来基于TNM分期系统的肿瘤分期标准可能会将免疫相关指标综合考虑在内[11]


mIHC/IF联合多种生物标志物预测免疫治疗效果或更具准确性


一项2019年7月发表在《JAMAOncol》囊括了10余种不同实体肿瘤类型的8135名患者的研究显示,mIHC/IF和多种生物标志物联用策略,或比仅PD-L1 IHC、肿瘤突变负荷(TMB)或基因表达谱(GEP)的免疫治疗疗效预测性能更佳[9]
研究共分析了8135名患者代表、10余种不同实体肿瘤类型的肿瘤标本。在此研究中,TMB、PD-L1 IHC、GEP的预测性能相似,而mIHC/IF和多种生物标志物联用策略或比单一PD-L1 IHC、TMB或GEP的性能更强[9]

不可否认的是,mIHC/IF对免疫治疗应答的预测效果还需进一步研究来证实,但不失为一种具有潜力的免疫治疗预测方法。

迈杰转化医学研究(苏州)有限公司已经建立并完善了多色免疫组织化学染色的技术平台和多个检测panel的方法学验证,能够对组织切片中多达6个免疫荧光标记物进行成像和分析(图2,6个免疫荧光标记物+1个核染色),可以对实体肿瘤微环境中的细胞表型和活性进行精准定量评估,同时提供了组织背景和细胞间相互作用的空间信息,具有卓越的技术方法优势。

迈杰转化医学mIHC工作流程包含三个主要环节:荧光标记-多光谱成像-组织图像分析。通过活性荧光团共价标记表位,多光谱成像则消除了荧光团的串扰和组织自发荧光的干扰,允许对组织样本中的每个荧光信号进行精确检测。组织图像分析确定了每个细胞和每个亚细胞间室的荧光强度值并形成可视化图像。部分已验证组合见迈杰转化医学mIHC成像示例图(图3)。

结合机器学习算法,分析系统能够识别组织的形态学区域(如肿瘤、真皮、基质、炎症),并提供每个区域的细胞计数和密度,以进一步分析(如特定细胞表型之间的距离映射)。除了荧光合成图像,分析系统还能够提供模拟亮场单色IHC,以改进目视判读。
作为一种极具潜力的免疫治疗预测方法,mIHC正逐渐出现在肿瘤相关领域研究者的视野中。一个对GC样本的研究表明,mIHC能够精确地显示具有复杂免疫表型的各种免疫细胞,以此表征TME。细胞角蛋白染色结果图像的数字分割可以显示瘤内和瘤周TME的空间信息[10]。通过对mIHC结果的进一步图像分析,研究人员能够实现分子的亚细胞定位,进一步拓展mIHC的应用[10]


参考文献
[1]Immunogenomic profiling determines responses to combined PARP and PD-1inhibition in ovarian cancer. Nature Communications. 2020
[2]Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011
[3]Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N EnglJ Med. 2010
[4]PD-1 blockade with nivolumab in relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. NEngl J Med. 2015
[5]Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. N Engl J Med.2015
[6]Comprehensive intrametastatic immune quantification and major impact ofimmunoscore on survival J Natl Cancer Inst. 2018.
[7]Quantitative multiplex immunohistochemistry reveals myeloid-inflamedtumor-immune complexity associated with poor prognosis. Cell Rep. 2017
[8]Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by masscytometry. Nat Methods. 2014
[9]Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol, 2019
[10]High-Throughput Multiplex Immunohistochemical Imaging of the Tumor and ItsMicroenvironment, Cancer Res Treat, 2020
[11]Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics,Modern Pathology, 2018