杰论系列 | 小斑点，大视野：ELISPOT在生物分析中的应用

ELISpot实验中，淋巴细胞在受到抗原或其他刺激后，局部会分泌细胞因子或免疫球蛋白，此细胞因子会被ELISpot板底PVDF膜上预包被的特异性抗体捕获。除去细胞后，加入生物素标记的检测抗体，之后再加入碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。加底物显色后，PVDF膜上出现不同颜色的斑点。每个斑点代表一个分泌了细胞因子或免疫球蛋白的细胞。

图1：ELISpot检测原理与实验步骤

由于ELISpot技术的独特优势，它已被广泛应用于多个领域：

1、 疫苗研发和临床评估：用于评估疫苗诱导的特异性免疫反应。

在临床试验和候选疫苗中，ELISpot方法是检测和评价疫苗的细胞免疫水平的国际公认的标准工具。中国药品食品检定研究院也在《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指导原则》等规定中均指出，ELISpot方法是检测和评价疫苗细胞免疫效价的有效方法。

疫苗研究中使用最广泛的ELISpot是IFN-γ测定，IFN-γ，作为一种由免疫细胞释放的关键细胞因子，在介导抗病毒免疫应答中扮演着不可或缺的免疫调节角色，具体涉及激活细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞及吞噬细胞等多种免疫效应细胞。疫苗接种后机体内IFN-γ的产生水平，实则是辅助性T细胞活化状态的一个直接反映，其高低可作为评估疫苗诱导免疫应答强度的重要指标。通过该测定，免疫激活后分泌物增加，因此代表了成功接种疫苗的良好生物标志物。

此外，对于mRNA疫苗，未经修饰的mRNA可能会被机体识别为外来物质而引发强烈的免疫反应，导致发炎和细胞死亡。通过ELISpot可以检测TNF-α等炎症因子，从而评价疫苗本身的免疫原性和安全性。

2、 细胞治疗的疗效评估：评估细胞治疗（如CAR-T细胞疗法）后患者体内特异性免疫细胞的变化。

CAR结构主要由三部分组成：一是位于细胞外的抗原识别结构域，二是跨细胞膜结构域，三是含有CD3ζ或共刺激分子的细胞内信号转导结构域。CAR-T细胞具有诱导体液和细胞免疫抗CAR应答的潜力，这些免疫应答主要是针对CAR的非自身成分或源自基因转移载体的残余蛋白，鉴于这些蛋白具有固有的免疫原性，监测其引发的免疫反应显得尤为重要。

Burdno^[1] 于2020年进行的一项对比研究中，运用ELISpot技术对Car-T细胞治疗前后的患者外周血单核细胞（PBMCs）进行了深入分析，以评估宿主T细胞群体对引入的Car-T细胞的特异性免疫反应。

3、基因治疗的毒性评估：检测基因治疗过程中可能引起的免疫反应。

在《Human Gene Therapy for Hemophilia》2020年版指南中，美国食品药品监督管理局建议申办者考虑通过ELISpot试验评估PBMC的IFN-γ分泌水平，以此作为监测针对载体及抗凝血因子T细胞反应性的有效方法，并强调在前两年的随访期内实施短期而密集的监测策略。

随后，在2021年《Human Gene Therapy for Neurodegenerative Disease》的指南中，FDA指出，对基因治疗产品的免疫反应可能会带来重要的安全风险，特别是这些反应可能损坏携带治疗性转基因的病毒载体转导的组织。FDA建议申办者需全面监测患者的全身免疫反应，并进行免疫测定，测量对载体和转基因蛋白的细胞和体液免疫反应，从而确保治疗过程的安全性与有效性。

“The AAPS Journal”上的综述文章“Evaluation of Cellular Immune Response to Adeno‑Associated Virus‑Based Gene Therapy”为评估腺病毒特异性细胞免疫反应提供了建议和指导，强调了ELISpot和FluoroSpot检测在这些评估中的作用^[2] 。

Kathryn等^[3] 人也报告称，针对valoctocogene roxaparvovec（Roctavian®）这一基因治疗产品的III期临床研究中，为了聚焦于更为成熟且关键的细胞因子评估，团队优化并生物分析验证了一种灵敏、稳定、可靠的IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)检测。从I/II期临床研究中使用的充分表征的双色FluoroSpot试验过渡到经验证的IFN-γELISpot试验，该评估用作AAV特异性细胞免疫应答的标志物。

         A                        AAV5 Specific IFNγ ELISpot

         B                     FVIII Specific IFN-γ ELISpot

图2：（A）用AAV5衍生肽库和（B）转基因表达蛋白质衍生肽库刺激PBMC后的IFN-γELISpot测定结果

对AAV5衣壳蛋白的细胞免疫反应检测中（图A），16名受试者的基线样本均为阴性，最早在给药后2周开始呈阳性反应，大多数受试者在数周内减弱，恢复为阴性。针对转基因产物FVIII的细胞免疫反应要少很多（图B），16名受试者中只有5名间歇性检测到阳性。

4、ELISpot其他应用：感染性疾病的研究与诊断、自身免疫性疾病研究、药物筛选、以及移植免疫研究等方面。ELISPOT技术以其高灵敏度、高特异性和单细胞水平检测的优势，在药物研发和临床诊疗中发挥着越来越重要的作用。

在细胞治疗，基因治疗和疫苗研发的蓬勃浪潮下，细胞免疫分析工作需要在受监管的环境中执行，以确保这些药物治疗的安全性和有效性。然而，当前领域内面临的一大挑战是， ELISpot的开发与验证尚缺乏统一、明确的监管指引。因此，GCC推出了详尽的白皮书，旨在促进不同实验室间就ELISpot实验验证所需的关键参数达成共识，从而加速标准化进程。我司拥有生物分析的相关检测平台和丰富的经验，期待更多的技术交流和合作。

[1]Brudno J N, Lam N, Vanasse D, et al. Safety and feasibility of anti-CD19 CAR T cells with fully human binding domains in patients with B-cell lymphoma [J]. Nature medicine, 2020, 26(2): 270-280.

[2]Gorovits B, Azadeh M, Buchlis G, et al. Evaluation of cellular immune response to adeno-associated virus-based gene therapy [J]. The AAPS journal, 2023, 25(3): 47.

[3]Patton K S, Harrison M T, Long B R, et al. Monitoring cell-mediated immune responses in AAV gene therapy clinical trials using a validated IFN-γ ELISpot method [J]. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 2021, 22: 183-195.