CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T cell)，即嵌合抗原受体(CAR)T细胞，是一种新的细胞疗法，从患者身上获取自体T细胞并进行基因修饰以表达嵌合抗原受体。这些受体由细胞外的scFv组成，该scFv被设计成与高特异性靶标结合，以及由共刺激结构和T细胞受体（TCR）zeta链组成细胞内部分
[1,2]。这些修饰的目的是产生一种T细胞，当暴露于靶分子时，它将以高特异性在体内激活和扩增。和其他免疫疗法类似，它的基本原理就是利用自身的免疫细胞来清除癌细胞，从而达到治疗肿瘤的目的，而且还可形成免疫记忆T细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。
图1：自体CAR-T细胞制造过程示意图[3]
2、利用基因工程技术给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体，T细胞变成CAR-T细胞；
3、体外培养，大量扩增CAR-T细胞，一般一个病人需要几十亿，乃至上百亿个CAR-T细胞(体型越大:需要细胞越多)；
5、严密监护病人，尤其是控制前几天身体的剧烈反应。
图2：CAR-T疗法的作用机制
[4]
CAR-T 细胞疗法目前主要应用于血液肿瘤领域，包括儿童和成人急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)等恶性肿瘤。随着临床研究的不断开展，针对不同靶点的CAR-T细胞疗法还有望应用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性髓系白血病（AML）及实体瘤等领域。
临床药理学是研究人体药代动力学（Pharmacokinetics，PK）和药效动力学（Pharmacodynamics，PD）的学科，其作为药物上市前临床研究不可缺失的研究内容，不仅在药物整体研发策略和各关键时间点发挥着重要作用，同时也是支持探索性和确证性临床研究设计和上市申请的重要科学依据。所谓药代动力学（PK），是指药物进入人体后，随着时间推移，药物浓度发生代谢变化的过程，这个过程也体现了人体对药物产生的影响[5]。CAR-T作为一种活的细胞药物，纵向监测CAR-T细胞在体内的药代动力学是临床工作的重要组成部分，为评估治疗反应和相关副作用提供有价值的信息。因此，为了确保患者的安全和药物的疗效，监测CAR基因的拷贝数以及转基因整合到患者T细胞中的位置对于CAR-T细胞制造商至关重要。
载体拷贝数(Vector copy number, VCN)，一个CAR所特有的转基因拷贝数的平均定量T细胞产物，是一个必须在病人给药前报告的特征，VCN增加了插入性突变的风险[6]。给药前CAR-T细胞产品中的转基因拷贝信息（载体拷贝数（VCN））对于保证患者安全至关重要，因为其直接关系到给药后监测CAR-T细胞的动力学对患者随访以及指导接受CAR-T细胞治疗的患者的临床决策。因此，CAR-T细胞的研制需要评估转导效率和载体拷贝数，以对其进行质量控制，临床应用的CAR-T细胞也应受到严格监管，因此需要适当的方法来评估CAR-T细胞产品中的载体拷贝数，监测输送到患者体内的CAR-T细胞。CDE发布的《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》明确规定CAR基因拷贝数≤5 copies/细胞。
CAR-T VCN的检测方法主要有荧光定量PCR(Q-PCR)、数字PCR(ddPCR)、流式细胞术三种方法。荧光定量PCR是一种依据倍比稀释的标准品扩增的Ct值来推算待测样本中目标分子含量的一种定量PCR技术，是目前监测CAR拷贝数常用的手段。然而，由于CAR结构的多样性和复发性，部分CAR-T产品如瑞基奥仑赛尚无有效的引物和探针，而且荧光定量PCR需要已知浓度的标准品，另外CAR-T拷贝数准确性完全依赖于标准品的准确性，标准品的制备使操作更复杂，限制了其在各大医院的常规检测。流式细胞法是指用荧光试剂（通常是单克隆抗体）标记细胞悬液，通过每个细胞的荧光特征，进行细胞分群，以确定CAR-T细胞的数量。用于检测细胞表面CAR表达的试剂，主要包括针对CAR的scFv结构域、蛋白L或目标抗原本身等多种特异性单克隆抗体。缺点主要是方法标准化较差（实验室之间的数据不具可比性），同时灵敏度较低，对样本及试剂要求比较高。数字PCR具有高度的敏感性、特异性和可重复性，且定量无需标准曲线，实现绝对定量，是一种可以用于准确定量稀有事件的定量PCR技术，数字PCR检测CAR-T拷贝数在临床上应用越来越多。
2023年生物分析研讨会中的热门话题就包括数字PCR的应用，指出了数字PCR的一些应用场景，包括基因和细胞治疗产品生物分析，且与传统的qPCR相比具有一些关键优势，尤其在用于基因治疗的组织生物分布（如AAV）和载体脱落研究以及不同载体位点的连锁和载体完整性等方面得到广泛应用。此次研讨会提供了更多将dPCR与qPCR用于基因治疗应用进行比较的案例研究，以及如何进行dPCR验证的建议，并提供了不同的研究案例。这些研究案例及相关数据促成了最新的关于dPCR建议的共识性推荐。与会者一致认为，在无法绘制标准曲线的情况下，以及需要更高灵敏度的场景下，dPCR的绝对定量能力明显优于qPCR[7]。
图 3：数字 PCR工作原理和流程
数字PCR是最新一代的核酸检测，是一种基于单分子模板PCR扩增，无需使用标准曲线，对样品核酸进行定量的分析方法：
1、借助微液滴或微孔将反应体系分隔为有限数量的独立微体系；
如图4所示，用数字PCR技术检测5~250000拷贝的CAR-T细胞，理论值与检测值线性良好。
图4：CAR-T拷贝数检测二维图和线性图，FAM为插入基因信号、VIC为内参基因信号
对1例接受细胞治疗的实体瘤患者进行药代动力学实验，在治疗前，治疗过程中和治疗后对其体内CAR基因拷贝数进行监测。
图5：实体瘤患者体内CAR基因拷贝数监测结果
对1例接受细胞治疗的血液瘤患者进行药代动力学实验，在治疗前，治疗过程中和治疗后对其体内CAR基因拷贝数进行监测。
图6：血液瘤患者体内CAR基因拷贝数监测结果
迈杰转化医学具有多个数字PCR CAR-T拷贝数检测项目经验
，包括外周血样本、外周血PBMC样本、骨髓样本、肿瘤穿刺样本、新鲜组织样本以及FFPE样本等多种类型样本的CAR-T拷贝数检测，为广大药企客户临床研究和肿瘤患者提供了大量的精准检测服务，已积累了丰富的检测体系开发验证和检测经验，获得市场认可。
参考文献
[1] Boyiadzis MM, Dhodapkar MV, Brentjens RJ, Kochenderfer JN, Neelapu SS, Maus MV, Porter DL, Maloney DG, Grupp SA, Mackall CL, June CH, Bishop MR. Chimeric antigen receptor (CAR) T therapies for the treatment of hematologic malignancies: clinical perspective and significance. J Immunother Cancer. 2018 Dec 4;6(1):137.
[2] Salter AI, Pont MJ, Riddell SR. Chimeric antigen receptor-modified T cells: CD19 and the road beyond. Blood. 2018 Jun 14;131(24):2621-2629.
[3] Ayala Ceja M, Khericha M, Harris CM, Puig-Saus C, Chen YY. CAR-T cell manufacturing: Major process parameters and next-generation strategies. J Exp Med. 2024 Feb 5;221(2):e20230903.
[4] Lu J, Jiang G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 2022 Oct 8;21(1):194. doi: 10.1186/s12943-022-01663-0. PMID: 36209106; PMCID: PMC9547409.
[5] 2021年CDE《创新药临床药理学研究技术指导原则（征求意见稿）》
[6] Murphy LA, Marians RC, Miller K, Brenton MD, Mallo RLV, Kohler ME, Fry TJ, Winters AC. Digital polymerase chain reaction strategies for accurate and precise detection of vector copy number in chimeric antigen receptor T-cell products. Cytotherapy. 2023 Jan;25(1):94-102.
[7] Mora J, Palmer R, Wagner L, et al. Bioanalysis. 2024,16(7):77-119. 10.4155/bio-2024-0024.
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