杰论系列 |流式细胞术在CAR-T治疗研究中的应用

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR-T)是通过基因工程技术将自体或异体T细胞改造成针对肿瘤特异性抗原的新型杀伤细胞，具有特异性强、效率高、非MHC限制等优点,在复发/难治性血液系统肿瘤和部分实体瘤中取得了良好的治疗效果。近年来,随着流式细胞术（FCM）的迅速发展，使其在CAR-T细胞的设计构建、患者入组、CAR-T细胞产品的性能检测、治疗后疗效评价、免疫功能评价、复发机制研究与后续治疗方案的选择等各个环节都起到重要的作用 ^[1] 。

图1：流式细胞术在CAR-T细胞免疫治疗中的应用情况

图2：CAR-T细胞免疫治疗流程图

1、 血液样本免疫细胞亚型分析

一般情况下，研究者在抽提患者/正常人血液样本后，会对样本中免疫细胞亚型进行分析。通过细胞特异性荧光抗体与相关抗原结合，利用流式细胞仪检测荧光信号，可实现不同免疫细胞类型比例的信息展现。例如，鉴别B细胞的常见免疫指标包括CD3、CD14、CD19、CD33、CD64等（B-ALL患者指标表达情况：CD3-CD14-CD64-CD33loCD19+），T细胞包括CD3、CD4、CD8等^[2][3]。此外，在CAR-T回输人体后，亦需要检测免疫细胞亚群的比例，以评估治疗效果。例如，通过流式细胞仪分析接受CAR-T治疗前后的B-ALL患者免疫细胞亚群分布，可见CD3-CD19+B细胞量会明显升高，说明CAR-T免疫治疗发挥一定疗效 ^[4] 。

图3：流式检测接受CAR-T治疗患者血液中CAR-T细胞含量^[4]

细胞状态监测几乎是贯穿整个研究的充分必要环节。目前，常见的活性状态检测工具有死活染料（如7-AAD、PI、ZombieTM）、非抗体类化学荧光探针（如CFSE、Calcein-AM、Tag-it VioletTM）等。除活性染料外，检测细胞凋亡用的Annexin V检测试剂盒、Apotracker™等亦能协助监测细胞的活性。以上染料/探针与细胞发生作用后，释放一定强度的荧光信号，通过流式细胞仪追踪信号可判断细胞状态^[5][6]。

图4：（左）利用Anexin V-APC对转染不同CAR结构的CAR-T细胞凋亡水平进行检测；（右）利用CFSE染料追踪CAR-T细胞在肿瘤细胞共培养环境下的增殖情况 ^[5]

3、T 细胞分选

T细胞成功分选是CAR-T治疗研究中的重要环节，可通过流式/磁珠分选的方法获得纯度相对较高的T细胞。相对于流式分选而言，磁珠分选具有操作简便、简单高效的优势，已被广泛报道应用于T细胞分选过程。此外，有研究报道，在此增加CD4+、CD8+T细胞亚群的分选流程尤为重要。如下图示，通过对患者血液中细胞进行特异性荧光抗体标记，利用流式细胞仪实现不同T细胞亚群的比例监测与分选 ^[7]。

图5：B-ALL患者血液中的T细胞亚群分型鉴定^[7]

4、T 细胞激活与扩增

当成功分离出T细胞后，接下来需要对T细胞进行刺激活化与扩增。常见的T细胞体外活化用工具包括抗CD3、CD28抗体、细胞因子IL-2等。据Gargett等报道，CD3/CD28联合细胞因子IL-4、IL-15共同培养，有助于获得扩增性和持久性更佳的CAR-T细胞。在此扩增培养过程中，T细胞分化成不同亚型，如TEM、TCM细胞等，每种T细胞均可通过特定的免疫指标进行鉴别测定（图6），此时，流式细胞仪便可协助完成这项工作^[8]。

另一方面，扩增过程可以利用常见示踪染料如CFSE、Tag-it-violetTM等进行追踪，通过流式细胞仪获取荧光信号，从而判断增殖周期。

图6：不同T细胞亚型特异性指标表达情况^[8]

5、 转染效率检测

CAR-T细胞构造另一重要环节是转染CAR至T细胞内。转染用质粒常带有标记基因如GFP、RFP等，通过EXFLOW流式检测荧光信号可量化细胞的转染效率^[9]。

图7：流式检测CAR经慢病毒转染至T细胞的转染效率（左：未转染T细胞；中：健康患者T细胞转染效率；B-ALL患者T细胞转染效率）^[9]

6、CAR-T 细胞质量检测

当CAR-T细胞构建成功并回输至活体前，需要安排动物实验以进行CAR-T细胞的效价评估，评估内容包括炎症因子检测、目的细胞亚群检测等；而当CAR-T输至人体时，同样需要检测患者血清中的细胞因子浓度，以监测预防细胞因子风暴的出现。其中，炎症相关细胞因子和趋化因子如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra等均是已有报道的监测对象^[10]。

图8：流式检测已转染anti-CD19-CAR的T细胞炎症因子表达情况^[4]

参考文献

[1] 中国中西医结合学会检验医学专业委员会. 流式细胞术在嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗相关检验中的应用专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2022,45(8):790-801.

[2] Levine B L, Miskin J, Wonnacott K, et al. Global manufacturing of CAR T cell therapy[J]. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2017, 4: 92-101.

[3] Gardner R, Wu D, Cherian S, et al. Acquisition of a CD19-negative myeloid phenotype allows immune escape of MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T-cell therapy[J]. Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 2016, 127(20): 2406-2410.

[4] Kochenderfer J N, Dudley M E, Feldman S A, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor–transduced T cells[J]. Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 2012, 119(12): 2709-2720.

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[6] Ren J, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, Zhao Y. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistant to PD1 Inhibition. Clin Cancer Res. 2017;23(9):2255–2266.

[7] Turtle C J, Hanafi L A, Berger C, et al. CD19 CAR–T cells of defined CD4+: CD8+ composition in adult B cell ALL patients[J]. The Journal of clinical investigation, 2016, 126(6): 2123-2138.

[8] Riddell SR, Sommermeyer D, Berger C, et al. Adoptive therapy with chimeric antigen receptor modified T cells of defined subset composition[J]. Cancer journal (Sudbury, Mass.), 2014, 20(2): 141.

[9] Pan J, Yang J F, Deng B P, et al. High efficacy and safety of low-dose CD19-directed CAR-T cell therapy in 51 refractory or relapsed B acute lymphoblastic leukemia patients[J]. Leukemia, 2017, 31(12): 2587-2593.

[10] Xu XJ, Tang YM. Cytokine release syndrome in cancer immunotherapy with chimeric antigen receptor engineered T cells. Cancer Lett. 2014;343(2):172–178.