污染，是分子检测 实验室出现假阳性、假阴性、 结果不可信 或难以判断等的重要原因。分子检测 实验室应当将污染 控制 作为日常管 理、实验 排班 、清洁消毒、 操作 习惯的核心 关注因素 。 分子检测实验中，除了最主要的 污染源核酸 外，在新兴的微生物菌群宏基因组等检测中， 细菌和其他 病原物的 污染 也不容忽视。以下简单讨论下分子检测 实验室的主要污染来源、如何避免和减少污染 发生 及发生污染的应急处理方案。
1、样本间交叉污染
样本制备时的污染，如使用未消毒的刀片进行批量样本的连续切片；收集血液的采血管被污染或管塞密封不严导致血液外溢；样本移液操作时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及离心管，枪头等一次性耗材等未及时充分灭菌；样本开盖、高速离心、剧烈震荡、反复吹吸时逸散形成气溶胶等。
2、实验试剂污染
在分子检测实验室中，经常会使用阳性质粒，阳性细胞系核酸等质控品，这些质控品在制备，分装和加样中，如果操作不当，就可能污染 移液器、容器、阴性对照及其它试剂。在高通量测序中，分析标签源性的污染会导致结果模糊不清，难以判断。
3、扩增产物污染
这是PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PC检测数个拷贝的极限，所以极微量的 扩增 产物污染，就可形成假阳性 环境 。
依从国标GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》制定实验室污染控制标准操作程序应包括以下主要内容：
1、严格执行各区功能划分
按照各区独立、单一流向的方针进行实验室划分各个功能区，各个功能区在物理空间和实操过程中都应处于完全分隔状态，确保各区之间空气不会直接流通。各区均应设置缓冲间，与缓冲间应有一定的相对低压，各功能区应设置与操作过程流向一致的压力差，保证合理的空气流向，防止污染。
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试剂准备区进行试剂的制备、分装和反应混合液的制备。本区为洁净区，存放于此区域的试剂转出后，不可逆行由后续操作的区域进入。尤其要注意的是，试剂盒中的阳性质控品不能储存在该区。
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样本准备区为半污染区，是最容易发生交叉污染的功能区。在本区进行核酸提取与浓度纯度定量测定。其他功能区可在超净工作台中进行操作，但在样本准备区必须配制生物安全柜。
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文库制备区为半污染区，用于文库的构建。杂交捕获、扩增子法等文库制备方法均有通过PCR放大文库产量的步骤，因此应在文库制备区构建文库，纯化等后续操作应待将文库扩增产物传递至功能区再进行。另外，对组织样本做片段化处理时应在单独划分的区域中进行。
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杂交捕获区为半污染区，用于文库扩增后的纯化，以及后续的二次扩增或捕获富集等步骤。此区域容易发生扩增产物及气溶胶等对其它区域的污染，尽量避免人员、物品等在该区与其它功能区之间流动。
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文库扩增区为半污染区，对杂交捕获产物进行PCR扩增富集，并对上机测序前的文库进行质控、上机前的稀释混样。
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电泳区为半污染区，用于核酸样本质量和文库片段的凝胶电泳、毛细管电泳等分析。
2、清洁的实验用品
实验室自配试剂（去离子水、无酶水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。
3、正确的实验操作
实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换，在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套等个人防护用品。 试剂反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体 集中 至管底 ，降低 污染手套或加样器的风险； 谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶。
吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行，遵守「慢吸快打」原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生。
试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数；批量检测时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入核酸，请勿同时开盖，尽量保证单人单管，实现完全闭管操作。尤其要注意阳性质控品的操作。
样本、试剂、文库和扩增产物应该保存在不同的冰箱中。
4、规范的实验设计
应遵循实验室内部质量控制的相关规定，实验中设立阳性、阴性和空白质控品，全程质控实验过程，验证检测的可靠性，并协助判断扩增系统的可信性。
在生信分析流程中，设置样本交叉污染监控环节。可以筛选在目标人群中的中频变异丰度的SNP，选取一套在人类基因组中分布较为均匀的代表组作为样本交叉监控SNP，通过监控SNP组的纯合度来判断样品的交叉污染程度，并定位污染源。
在连续检测中，需要设置一些已知突变丰度突变阳性的质控品，在每个检测批次中都将质控品和样本平行检测，对质控品的检测结果进行记录和趋势分析。
图1：近3个月多基因突变丰度趋势图
1、核酸样本溢出时
立即用吸水纸覆盖，由外围向中心倾倒1 0%的次氯酸消毒剂，约半小时 后，清除污染物品，再用 次氯酸消毒剂擦拭，并用 75%酒精喷洒，紫外车照射1 - 2小时。
2、出现不明情况污染时
应暂停 所有实验操作；清理实验室内所有 可能被污染的耗材 ，寻找污染来源； 加大实验室的通风； 对实验室内所有表面（台面、地面及墙面）进行消毒； 75% 酒精空中喷雾；
开启紫外消毒装置，进行超过4小时的紫外照射。污染消除后，使用新批次的试剂和空白质控品进行连续3次检测，连续3次均为阴性结果后方能开展正常的样品检测。
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