杰论系列 | 2023年生物分析研讨会白皮书-PCR相关

2023年6月19日至23日，2023年生物分析研讨会如期在美国佛罗里达州奥兰多迪士尼泉举行，来自制药/生物技术公司、CRO和多个监管机构的1000多名专业人士就生物标志物、免疫原性、基因治疗、细胞治疗和疫苗等主题召开了3个主研讨会和7个专业研讨会。

会议中的热门话题包括：dPCR的应用、ELISpot在评估细胞免疫原性中的作用、NanoString和NGS检测方法的开发与验证、qPCR检测方法的开发与验证、疫苗临床检测的国际参考标准、抗AAV TAb的评估、LNP免疫原性的进一步考虑、疫苗临床检测的生命周期管理、AAV TAb/NAb的评估、转基因免疫原性的评估、疫苗免疫原性的评估、复制型病毒载体的PK和生物分布、病毒载体疫苗的PK和生物分布以及CAR-T细胞的PK和生物分布等。 其中与PCR相关的三大议题被广泛讨论，与会者深入交换了意见，产生了新的年度共识与建议。

在议题“Rise of dPCR”（数字PCR的兴起）中，与会者主要就两个问题进行了讨论：

1、在哪些场景下dPCR比qPCR更受青睐？

用于DNA或RNA的数字PCR（dPCR）已成为基因和细胞治疗产品生物分析的一种常见检测平台，与传统的qPCR相比具有一些关键优势，尤其在用于基因治疗的组织生物分布（如AAV）和载体脱落研究以及不同载体位点的连锁和载体完整性等方面得到广泛应用。2020年和2021年的《生物分析白皮书》深入讨论了qPCR和dPCR之间的差异。2021年的白皮书详细阐述了验证的最佳实践，包括分析批的接受标准、定量下限（LLOQ）、最低检测限（LOD）以及精密度/准确度等要求。之前的专家共识包括使用加标质粒的QC样本对精密度、准确度、灵敏度、选择性、定量下限和短期稳定性进行验证等。

2021年的专家共识建议之后，2022年的GCC白皮书从CRO的角度对dPCR的开发和验证达成了更多共识。一致认为，在dPCR验证期间进行的实验在总体上与qPCR相似，而dPCR的实验和技术设计中有一些独特的方面与qPCR有根本的不同（例如，没有标准曲线，也没有不同的持家基因）。最后，2022年的《生物分析白皮书》根据上述验证建议中的问题提供了更多的案例研究、实际考虑和建议。这些共识包括对于组织生物分布报告单位为拷贝数/μg基因组DNA、大会还为通过监测质控品来确认仪器的重现性等方案提供了其他指导。

2023年的讨论提供了更多将dPCR与qPCR用于基因治疗应用进行比较的案例研究，以及如何进行dPCR验证的建议。dPCR和qPCR都可以测量靶基因，以评估组织转导（嗜性）、生物分布、mRNA表达或调节以及载体脱落等。会议重点讨论了一个使用反义寡核苷酸（ASO）测量抗肌营养不良蛋白mRNA外显子跳跃的研究案例。在该案例中，dPCR比qPCR表现更好。编码抗肌营养不良蛋白的杜氏肌营养不良（DMD）基因外显子跳跃定量是一个具有相当挑战性的检测。因为DMD mRNA的丰度较低，低至约5-10个拷贝/细胞核。以前使用巢式PCR或带有预扩增步骤的qRT-PCR等方法均倾向于低估了跳跃PCR产物，导致与dPCR相比，跳跃率高估了约2倍。数字PCR出来计算更准确外，还显示出更高的灵敏度和更好的精密度。

其他研究案例提供了转基因和AAV定量的数据。在一项研究发现了一种意外的变化模式，即在AAV给药后，随着时间的推移，随着蛋白质表达增加，而通过dPCR定量得到的AAV载体基因组串联体形成的拷贝数却在减少。在该研究发现，用EcoR1（一种位于AAV基因组反向末端重复序列（ITRs）内的限制酶）消化的组织样本，与未消化的样本或用Nru1（一种不在AAV基因组中的限制酶）消化的样本相比，每个细胞中的拷贝数要高得多。这些结果表明，单链AAV DNA进入细胞核后会形成串联体，以及如果不在ITR内用适当的限制酶进行消化，dPCR将无法准确测量AAV载体基因组串联体的拷贝数。

另一项研究案例则展示了对不同dPCR平台的性能比较。所有dPCR平台都基于相似的原理运行，然而它们的性能可能会因仪器设计、液滴数量的一致性、阴性液滴的区分能力、空载液滴的“雨”状分布和/或分区方法的不同而有所变化。由于dPCR定量不需要校准曲线，dPCR平台之间的一致性可能是生物分析工作者需要关注的一个大问题。

相应地，行业标准的制定与标准物质的制备化工作也在如火如荼地进行中。为了提高不同平台和实验室间dPCR结果的可比性和重现性，包括开发参考物质、制定行业指南和质量控制措施的大量工作都在进行中。大会建议使用共同的参考样本或标准品，并在相同的样本和条件下对不同平台进行比较分析。在为特定应用选择dPCR平台之前，研究者应仔细考虑不同平台的优缺点。某些平台可能更适合特定类型的样本或目标，这取决于靶标浓度、分子量大小和结构复杂度等多个因素。数字PCR目前仍然是在基因治疗研究中实现高精度和高灵敏度分析的宝贵工具。然而各种研究案例也强调，对dPCR检测进行仔细的评估、优化和验证，尤其是在评估AAV基因治疗的生物分布等研究中对于获得可靠的结果至关重要。

这些研究案例及相关数据促成了最新的关于dPCR建议的共识性推荐。与会者一致认为，在无法绘制标准曲线的情况下，以及需要更高灵敏度的场景下，dPCR的绝对定量能力明显优于qPCR。

迄今已有近1000项细胞和基因治疗临床试验正在进行，以研究新型治疗机制。对于成功提交监管申请来说，可靠地定量以及确定这些最先进的CAR-T产品的定位/生物分布至关重要。监管方对在获批的CAR-T疗法的临床监测和生物分布过程中所采用的关键分析工具（例如流式细胞术、PCR和多重免疫荧光）进行了严格审查，并通过支持性的患者研究案例展示了这些检测方法所面临的挑战。

由于对这些检测方法的需求显著，从2018年至今，它们一直在《生物分析白皮书》中不断被讨论。最初的建议是流式细胞术是监测循环CAR-T细胞扩增以及CAR-T细胞动力学的主要平台。2021年的白皮书比较了用流式细胞术进行的直接测量和用qPCR进行的间接测量（定量拷贝数）。近年来，由于绝对定量（无需校准物）的优势以及投入DNA量减少近6倍（600 ng对比3200 ng），dPCR也被越来越多地使用。建议方法的选择应反映对当前研究问题的考虑以及每种方法的优缺点。

2023年大会除了回顾流式细胞术、qPCR和dPCR在CAR-T监测方面的优缺点外，还讨论了采用更新的方法的研究案例，例如在临床中使用荧光ISH-IHC对患者活检样本进行CAR-T生物分布的研究。多重ISH和IHC可以通过CAR-T肿瘤相互作用评分展示组织归巢以及与肿瘤负荷的相关性。

基于新平台的新数据，专家小组还讨论支持了之前关于临床试验中CAR-T监测的挑战以及选择CAR-T监测检测类型（例如流式细胞术与qPCR和其他基于活检的平台等）的标准的讨论和建议。监管机构分享并认可了经验和挑战（复杂的检测开发、除非看到信号否则活检难以获得、报告标准）。监管要求是在不良事件（例如继发性恶性肿瘤或安全性）的情况下收集活检进行分析，或者用于与疗效的相关性研究。与会者一致认为，除上述此之外的活检是出于研究兴趣，取决于申办方的判断。因为活检样本可能难以获得。大会继续支持之前的建议：即对于监测而言，与qPCR相比流式细胞术更受青睐，以避免由死亡或凋亡的CAR-T细胞释放的DNA对结果造成潜在的混淆。